编者按：随着小麦基因组测序完成及释放，大量的小麦基因克隆被报道出来，截止年11月，据不完全统计，超过10个控制抗病、农艺性状、产量等基因相继报道（包括文章发表和会议摘要）。人们常说小麦的春天已经来了，然而，真的是这样吗？在我们欢欣鼓舞之际，是否冷静下来思考过这些问题。今年克隆的两个控制小穗数的基因，只发在了TAG上；还有克隆芒长基因相继有3篇被报道出来，据说还有一些课题组也在做，但进度没有赶上......这种问题后面可能会更多。本文作者系中科院遗传所张爱民研究员课题组博士，芒长基因克隆者，受我们邀请，王博士进行了深入的思考，他的科研经历及一些观点建议我相信对大家有很多的启发。以下为原文，请欣赏：
提起麦芒，大家应该都不陌生，不过，似乎在很多人眼里它是一个有点讨厌的家伙，每年小麦田间调查与收获时节，听到师弟师妹们抱怨最多的，莫过于夏季的炎热和时不时寻机会窜进衣袖狠狠刺痛她们的麦芒了。有时候就想，要是麦地里爬满西瓜，麦子都是胖乎乎光秃秃的，那该多好啊。可是，麦芒真的是个不利性状吗？
芒是小麦等禾本科作物穗器官的重要组成部分，小麦品种之间芒的差异如长短、形状及颜色是非常容易识别的特性。麦芒是由小花外稃的末端延伸形成一种变态叶，主要由绿色细胞、气孔、机械组织、维管束和表皮的芒刺等构成，这些结构决定了小小麦芒作用大：芒可以进行光合作用，是叶片光合作用的重要补充，麦芒对产量的贡献可达10%以上；与叶片、颖壳相比，芒的水分利用率更高，对热胁迫的耐受性也更好，干旱条件下，叶片和芒的光合速率都会下降，但是，芒的光合速率能够保持相对稳定；芒是坚硬的针状组织，表皮还生有刺，可以粘在动物的毛皮上进行传播、有效减少鸟类啄食、利用空气湿度的昼夜变化推动种子入土、减少因穗相互碰撞引起的落粒、种子脱落时可以起到平衡作用……。总之，芒是一个有利性状，对小麦的进化与传播、抗旱及产量等有着重要作用。小麦的芒长是一个数量性状，由多基因控制，之前的研究主要是针对B1、B2及Hd三个芒长抑制位点，但也仅仅停留在初步定位的层面上（注：年8月底，北卡罗来纳州立大学GinaBrown-Guedira团队和加拿大科学院JAllanFeurtado团队在《NewPhytologist》背靠背发表了小麦芒长抑制因子B1克隆的工作）。鉴于芒的重要作用，而其遗传基础又不是很明确，因此我们开展了以下几个方面的研究：
1.全基因组关联分析共检测到26个芒长的显著关联位点
通过对份材料组成的自然群体-三年两个种植密度共六个环境的芒长表型进行分析，发现芒长性状遗传力高（h2=0.），群体内芒长变异主要由遗传控制。采用混合线性模型进行群体WheatK基因分型结果和芒长性状的全基因组关联分析。定义1Mb内至少三个标记达到3.5的显著性阈值为一个SNP簇，我们将在最优无偏预测值（BLUP）中检测到、并且在至少三个环境中检测到的SNP簇作为一个稳定的显著关联位点，这样，我们一共鉴定得到26个显著关联位点（图1a）。通过显著关联位点与已报道的基因、QTL及标记位置比较，发现有七个显著关联位点与主效芒长抑制位点B1、B2、Hd和水稻An-1、OsETT2、SHL2及大麦Lks2基因共定位。各个关联位点的单体型分析表明，这些位点显著影响芒长，5A染色体长臂上的B1及qAL.5A.2一起可以解释43.15%的表型变异（图1c）。
图1芒长的全基因组关联分析
2.TraesCS5A02G启动子区的变异是引起B1位点抑制芒长的原因
GWAS检测到的B1关联位点LD区块为.00-.12MB。根据B1位点的标记基因型，我们构建了两套双亲遗传分离群体，这两个群体的极端集群分析（BSA）也在这一位置检测到了差异标记的显著富集（图2c）。通过对F2群体及衍生群体共单株SSR、InDel、CAPS/dCAPS标记扫描，将B1定位到了5A染色体长臂标记SSR88-dCAPS13之间Kb的物理区间（.–.Mb），包含2个基因TraesCS5A02G和TraesCS5A02G（图2d）。
图2B1的精细定位
为了确定候选基因，我们进行了表达谱分析和序列分析。TraesCS5A02G基因主要在穗部表达，短芒材料中表达量显著高于长芒材料（图3a），而TraesCS5A02G在短芒、长芒材料间表达量没有明显差异。TraesCS5A02G在短芒亲本（YMZ和NK）、长芒亲本（S和ND）间不存在序列差异。TraesCS5A02G的编码区不存在序列差异，但是在启动子区发现5个一致的差异SNP（图3c）。通过PacBio纳米孔测序技术对89个品种中这2个基因进行测序（包含~2Kb启动子区、编码区和~0.5Kb的3’-UTR），这些品种大部分为一个NAM群体的亲本，其B1位点的基因型已经进行了鉴定。我们发现B1/B1基因型的材料（n=23）在-、-、-和-位置表现为TAGA单体型，而28个b1/b1基因型的材料中27个表现为CGAG单体型（图3c）。用Sanger测序法对个无芒材料和个有芒材料中进行了单体型鉴定。在全部份材料中，表现为TAGA单体型的材料共有份，其中份为无芒材料（98.74%），表现为CGAG单体型的材料共有份，包括份有芒材料（b1/b1基因型），5份不含B1位点的无芒材料（b1/b1基因型，含有B2、Hd等）和5份为不能确定是否含有B1位点的无芒材料（图3d）。因此，单体型TAGA/CGAG可以很好地进行B1/b1位点的区分。TraesCS5A02G自身启动子的转基因功能互补验证表明其为B1芒长抑制位点的控制基因，命名为ALI-1（图3f）。顺式调控元件预测（PLACE）发现，无芒材料在-和-位置的变异导致一些重要元件的缺失（如低温响应、光诱导、分生组织/增殖细胞基因表达相关的元件），推测这些SNP可能是导致B1位点芒长抑制表型的功能突变（图3c）。此外，单体型CGAG还表现出粒长和千粒重的显著增加（图3e）。
图3B1位点的图位克隆
3.ALI-1通过抑制细胞分裂素介导的细胞增殖负调控芒伸长
转录组分析表明，在3个近等基因系短芒材料中均上调表达的基因共有8个（包括ALI-1），下调表达的基因共有16个（图4a）。ALI-1编码一个aa的C2H2锌指转录因子，荧光素酶报告系统实验表明，其具有强烈的转录抑制活性（图4b,c），因此ALI-1的直接下游靶基因理论上就应该在这16个下调表达的基因之中，包括生长素受体IAA2、细胞周期调控因子CDC25及转录因子bHLH99，在这3个基因的启动子区均检测到了锌指蛋白的保守结合序列A[AG/CT]CNAC。近等基因系的芒纵切结果表明，细胞长度没有差别，而长芒材料细胞数目是短芒材料的十倍（图4e,f），因此短芒材料芒原基的细胞分裂被抑制。细胞分裂素测定发现，长芒材料中主要活性形式tZ显著高于短芒材料（图4d）。此外，转录组KEGG富集结果表明，短芒材料中细胞分裂素信号转导的负调控因子A-ARR显著上调表达。因此，短芒材料受到了细胞分裂素的含量降低和信号转导抑制的双重影响。
图4ALI-1的作用机制
4.ALI-1显著降低粒长和千粒重
ALI-1近等基因系农艺性状考察发现长芒材料千粒重显著增加，其主要是由粒长的增加所引起的（图5a,b）。GWAS群体也观察到这个位点对粒长和千粒重的效应（图5c,d）。对已发表数据的分析发现，在ALI-1位点附近有粒长和千粒重的QTL。近等基因系种子发育动态观察表明，长芒/短芒材料间千粒重和粒长的差别是在种子发育的早期出现的（图5e）。bHLH99基因的种子发育动态分析和表达谱分析，表明bHLH99在籽粒发育早期高表达，ALI-1近等基因系长芒材料表达量显著高于短芒材料，且其主要在种子的表皮中表达（图5f-h）。目前，对于麦芒对产量的作用，人们的认识主要集中在芒的光合作用上。我们发现，芒可以影响千粒重和产量，不仅仅是因为芒可以进行光合作用增加源大小，更在于，芒长控制位点可以直接调控种子大小扩大库的容量，而ALI-1调控种子大小可能是通过调控bHLH99的表达实现的。
图5ALI-1对产量性状的影响
年10月19日《thePlantJournal》杂志在线发表了中科院遗传发育所张爱民研究团队这一研究成果(doi:10./tpj.)。博士研究生王冬至为该论文的第一作者，北京科技大学刘冬成教授和中科院遗传发育所张爱民研究员为该论文的共同通讯作者。该项研究得到国家重点研发计划和国家自然科学基金项目资助。
后记：
1、虽然B1基因已经被克隆，但是包括本文在内已发表的3篇文章对其功能突变位点仍然存在争议，还需要进一步的实验验证。
2、ALI-1可以同时调控芒长和籽粒大小，我们推测其是通过调控CDC25的表达调控芒长，而对籽粒大小的调控是通过bHLH99，但是否是这样仍需要进一步的实验证据。
3、芒长性状是一个数量性状，由多基因控制，研究清楚基因间是否存在互作、如何进行互作，对于我们理解小麦芒的发育具有重要意义。我们正在对GWAS检测到的其他重要位点如B2、Hd、qAL.5A.2进行克隆，以期望能在未来解释清楚这个问题。
4、随着小麦基因组得到释放和完善，小麦已经迅速迈向功能基因组时代，基因的克隆已经不再是小麦研究者大的障碍，如何在功能和机制上做精、做细、讲出一个完整的故事是一个值得思考的问题。这个工作从年初开始，年8月基本完成基因定位锁定候选基因，在之后的功能研究中走了很多弯路、吃了很多苦头，转基因的工作接连遭遇多次意外，以至于今年8月才拿到初步表型，致使工作的深入推进和文章发表出现很大的问题，希望大家引以为戒，避免像作者这样出现类似的低级错误。
5、除了功能基因组，如何抓住和借助表观组、调控组、表型组的新思想新技术也是需要思考的问题。作者从事正向遗传学的工作，但现在有一种深深的忧虑，那就是小麦的功能基因组时代会不会就像北京的秋天一样极为短暂。随着各种组学的研究不断推进，精于功能研究的水稻、拟南芥研究者不断转入小麦领域，传统的小麦研究者，下一步要往哪里走？小麦的春天在哪里？对于这个问题，作者没有答案，我们依然在路上。
参考文章
WangD,YuK,JinD,SunL,ChuJ,WuW,XinP,GregováE,LiX,SunJ,YangW,ZhanK,ZhangA*,andLiuD*.(),NaturalvariationinthepromoterofAwnLengthInhibitor1(ALI-1)isassociatedwithawnelongationandgrainlengthin